Qual è l’enzima più veloce per trasformare il chitosano in oligomeri antifungini?

Il chitosano, un derivato della chitina, può diventare un potente antifungino se lo si spezza in piccole catene chiamate oligomeri. Due enzimi prodotti dal batterio Bacillus thuringiensis B‑387 – la chitinasi (73 kDa) e la chitosanasi (40 kDa) – sono stati messi a confronto per capire chi è più efficiente. Dopo una purificazione in laboratorio, gli scienziati hanno aggiunto ciascun enzima a una soluzione di chitosano con grado di deacetilazione 85 %. La chitosanasi ha agito più rapidamente, creando oligomeri corti (da due a quattro unità di glucosamina) e, con meno tempo e meno enzima, ha prodotto anche molecole più grandi (da 2,4 a 66,5 kDa). La chitinasi, al contrario, ha richiesto più tempo e una maggiore quantità di enzima per ottenere risultati simili. I prodotti della chitosanasi si sono rivelati più solubili in acqua e hanno mostrato una migliore attività antifungina contro funghi patogeni delle piante, testata in vitro. Inoltre, la procedura di produzione della chitosanasi è più semplice e rende più alta la resa dell’enzima. Per questi motivi, la chitosanasi B‑387 appare più adatta a produrre oligomeri di chitosano con potenziali applicazioni in agricoltura sostenibile, riducendo l’uso di pesticidi chimici.

La chitosanasi B‑387 appartiene alla famiglia GH‑46 delle glicosidasi, caratterizzata da un sito attivo che riconosce specificamente i legami β‑1,4 tra unità di glucosamina (GlcN) e N‑acetil‑glucosamina (GlcNAc). La sua struttura a dominio singolo, con un peso molecolare di 40 kDa, consente una maggiore flessibilità conformazionale rispetto alla chitinasi GH‑18 (73 kDa), che possiede un dominio catalitico più rigido e una zona di legame più estesa. L’analisi TLC e LC‑ESI‑MS ha mostrato che la chitosanasi produce una distribuzione più stretta di oligomeri, prevalentemente di grado di polymerizzazione (DP) 2‑4, ma è anche capace di generare oligomeri di DP superiore (fino a 10) quando la concentrazione di substrato è aumentata. La cinetica di reazione, valutata mediante Michaelis‑Menten, ha rivelato un Km di 0,12 mg mL⁻¹ per la chitosanasi, significativamente più basso rispetto al Km di 0,35 mg mL⁻¹ della chitinasi, indicando una più alta affinità per il chitosano. Inoltre, la chitosanasi mantiene la sua attività in un ampio intervallo di pH (5,5‑8,0) e temperature (25‑45 °C), rendendola adatta a processi industriali a condizioni ambientali moderate. L’analisi NMR ¹³C ha confermato la presenza di legami β‑1,4 e β‑1,3 nei prodotti, suggerendo che la chitosanasi può effettuare sia idrolisi endo‑ che esogena, favorendo la formazione di oligomeri più solubili. Dal punto di vista biotecnologico, la produzione di chitosanasi in fermentazione di B. thuringiensis è elevata (≈ 150 U mL⁻¹) e la purificazione richiede solo una fase di cromatografia a scambio ionico, riducendo i costi di downstream. Queste caratteristiche, unite alla maggiore attività antifungina dei COS prodotti – attribuita alla loro capacità di interagire con la membrana cellulare dei funghi, alterandone la permeabilità – rendono la chitosanasi B‑387 un candidato ideale per lo sviluppo di biopesticidi a base di oligomeri di chitosano.